Estratégia de genetistas brasileños identifica genes responsables de la producción de azúcar en la cana de azúcar
Después de 18 años de publicación del genoma humano, el primer ADN completo secuenciado (en 2000), los genomas de 250 animales y 265 plantas (con exclusión de hongos y bacterias) se han mapeado hasta la fecha. De la familia de las gramíneas, a la cual pertenece la caña de azúcar, se secuenciaron 33 especies. Entre ellos se encuentran cultivos fundamentales para la humanidad como el arroz, la cebada, el maíz, el sorgo y el trigo. ¿Qué hay de la caña de azúcar? ¿Dónde está este genoma? Nadie ha sido capaz de secuenciar hasta el día de hoy. Cuando esto ocurra, imagina qué dividendos económicos provendrá de la mejora genética vegetal.
¿Qué falta para secuenciar el ADN de la caña de azúcar? Docenas de laboratorios en todo el mundo han intentado durante años secuenciar este genoma, pero la tarea es demasiado complicada. Hay dos estrategias para la secuencia: Top-down y bottom-up. La estrategia Top-down busca secuenciar el genoma de la caña de azúcar a partir del uso masivo de las máquinas de secuenciación de ADN, de las cuales surgen secuencias indescifrables con billones de bases. Estos, a su vez, son crujidos y minados por las técnicas más avanzadas de bioinformática, consumiendo decenas de miles de horas de potencia computacional durante todo el proceso. Es una estrategia costosa, exige mucha mano de obra y, hasta el momento, aún no ha dado los resultados esperados.
Pero hay otro método más económico para secuenciar el genoma de la caña de azúcar. Dicha estrategia no busca secuenciar todo el genoma, sino identificar aquellos genes específicos cuya función está vinculada a los aspectos del desarrollo de la planta que uno desea seleccionar. "No necesito conocer el genoma completo de la caña de azúcar para intentar identificar los genes responsables de la producción de azúcar", dice la genetista de plantas Anete Pereira de Souza, jefa del Laboratorio de Análisis Genético Molecular del Instituto de Biología de la Universidad Estadual de Campinas (Unicamp).
Esto se logró a principios de 2018 por Souza y su equipo, formado por Melina Mancini, Danilo Augusto Sforça y Claudio Cardoso-Silva. Son el primer grupo en identificar, en el medio del enorme almácigo genómico de la caña de azúcar, los genes candidatos para la producción de azúcar. El hallazgo, si se confirma, podría en teoría conducir a grandes saltos en el futuro en la producción de etanol y azúcar por hectárea de caña de azúcar plantada. O incluso aumentar el valor calorífico del bagazo de caña de azúcar producido por la industria del azúcar y el alcohol, que se quema en las plantas termoeléctricas. El bagazo con mayor poder calorífico significa una mayor producción de energía con menos cantidad de bagazo.
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| La caña de azúcar (Saccharum hybridum) es una especie híbrida cultivada en todo el mundo |
Un genoma (muy) complicado
El hecho de que hasta ahora ningún laboratorio haya podido mapear el genoma de la caña de azúcar se debe a la extrema complejidad de su ADN. El genoma de las plantas es ciertamente complejo, y el genoma de la caña de azúcar es uno de los más complejos que existen. El genoma de las plantas es más grande y más complejo que el genoma de los mamíferos, aves o reptiles y anfibios (los peces son una excepción). El ADN humano, por ejemplo, consiste en 3,2 mil millones de pares de bases dispersos en 23 pares de cromosomas, de un total de 46 cromosomas. El genoma del trigo, por otro lado, tiene 17 mil millones de bases divididas en 21 pares de cromosomas. El genoma de la caña de azúcar está compuesto por 10 mil millones de pares de bases, distribuidos entre 100 y 130 cromosomas. ¿Espera un minuto? Después de todo, ¿son 100 o son 130 cromosomas? Depende. Puede ser una cosa u otra, y cualquier otra en el intervalo entre ellos.
La caña de azúcar cultivada hoy en día es una especie híbrida (Saccharum hybridum) creada a partir de cruzamientos sucesivos de otras dos especies del género Saccharum: Saccharum officinarum y Saccharum spontaneum. El primero, S. officinarum, es caña de azúcar que originalmente fue domesticada en la isla de Nueva Guinea hace unos 8,000 años y comenzó a cultivarse en la India hace 3,000 años. Esta fue la especie cultivada en los ingenios de caña de azúcar del Brasil colonial y el resto del mundo. Más de tres siglos de endogamia han llevado a la pérdida de la diversidad genética. Esto significa que a mediados del siglo XIX, la producción de cultivos de caña de azúcar en todo el mundo comenzó a disminuir. Al mismo tiempo, la pérdida de vigor de la planta abrió las puertas al ataque de enfermedades y plagas contra las cuales la planta había perdido resistencia.
Para recuperar la producción, era urgente hacer que la caña de azúcar recuperara las defensas contra los agentes bióticos que lo atacaban. La planta necesitaba recuperar su vigor perdido. La solución fue cruzar S. officinarum con otra planta del mismo género, un pasto llamado S. spontaneum. "S. spontaneum no es caña de azúcar, es una hierba. No tiene azúcar, pero es resistente a enfermedades y plagas, y rica en fibra", explica Souza. "Fue un buen matrimonio. El híbrido resultante, S. hybridum, produce una gran cantidad de azúcar y es resistente a las plagas y enfermedades de la hierba".
Para llegar a S. hybridum, S. officinarum (caña de azúcar) se cruzó primero con el pasto S. spontaneum grass. A partir de esto, se obtuvo un primer híbrido, que era resistente a enfermedades y plagas, pero producía poca azúcar. Con el fin de aumentar el contenido de azúcar en la planta, se realizaron varios cruces sucesivos de los híbridos con caña de azúcar (S. officinarum). "Fue el hombre que creó la caña de azúcar híbrida que plantamos hoy: es fuerte y tiene una gran cantidad de azúcar", dice Souza.
Si, por un lado, los cruces sucesivos dieron como resultado un híbrido de calidad, por otro lado crearon una planta cuyo genoma es una mezcla heterogénea genética. La complejidad genómica de Saccharum radica en su tendencia de la caña de azúcar a la poliploidía, es decir, la multiplicación de los cromosomas. La mayoría de los organismos, incluidos los humanos, tienen un genoma diploide, que lleva dos conjuntos completos de cromosomas, uno heredado del padre y otro de la madre. Sin embargo, el género Saccharum es poliploide, es decir, lleva más de dos copias de cada cromosoma. En el caso específico de S. officinarum, la especie es octaploide. Durante el cruce, 10 cromosomas de plantas se multiplican por ocho. La planta recibe de cada uno de los padres no una, sino cuatro copias de cada cromosoma, totalizando un genoma con 80 cromosomas.
Para complicar aún más, en S. hybridum, el número de cromosomas no solo es mayor que 80 (debido a la inserción de ADN del pasto S. spontaneum). El total de copias de cada cromosoma recibido de ambos padres no es fijo, pero varía de ocho a 14 copias. Por lo tanto, el número de cromosomas no es el mismo para las diversas variedades de caña de azúcar híbrida. Hay individuos que pueden tener 100 cromosomas, mientras que otros tienen 112, 120 o incluso 130 cromosomas. Pero todos pertenecen a la misma especie.
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| Saccharum spontaneum es una especie de hierba del mismo género de caña de azúcar |
Barajado genómico
Para tener una idea de la complejidad del ADN de la caña de azúcar y el tamaño del problema que enfrentan los genetistas, imagine dos barajas hipotéticas de cartas. Uno se llama CAÑA DE AZÚCAR (S. officinarum) y el otro PASTO (S. spontaneum). Tienen alrededor de mil millones de cartas cada uno. Hay cuatro tipos de cartas: A, G, C y T. Las cartas A y G siempre están asociadas, sin importar su posición en la baraja. Lo mismo ocurre con las letras C y T.
Ahora tome barajas CAÑA DE AZÚCAR y PASTO aleatoriamente. El resultado es una baraja HÍBRIDA, con 2 mil millones de cartas. Luego tome la baraja HÍBRIDA y vuelva a mezclarla con una baraja CAÑA DE AZÚCAR. El resultado será un nuevo HÍBRIDO con 3 mil millones de cartas. Repita la operación siete veces, mezclando siempre la baraja HÍBRIDA resultante de la operación anterior con otra baraja CAÑA DE AZÚCAR.
¡Hecho! El resultado final es una enorme baraja HÍBRIDA con 10 mil millones de cartas, en la que las combinaciones de cartas A + G y C + T de las barajas originales CAÑA DE AZÚCAR y PASTO se mezclan en una proporción de 20% a 80%. Es decir, el 20% de las cartas provinieron de la baraja PASTO y el 80% provino de varias barajas CAÑA DE AZÚCAR utilizadas de forma consecutiva.
Este desorden monumental corresponde, de una manera muy simplificada, al genoma de la caña de azúcar plantado hoy. En la vida real, sin embargo, el ADN de la caña de azúcar es aún más complejo. Esto se debe a que, durante los cruzamientos sucesivos entre S. hybridum y varias generaciones de S. officinarum, además de la acumulación de repetidos pares de bases de S. officinarum, se producen duplicaciones aleatorias de genes.
El desafío para los investigadores que intentan secuenciar y mapear el genoma de la caña de azúcar es descifrar, en medio de miles de millones de repeticiones y duplicaciones, las secuencias base (las cartas en nuestra baraja hipotética) A, T, C y G que originalmente estaban en S. spontaneum y S. officinarum, así como identificar sus posiciones en el gigantesco genoma híbrido. Es una pesadilla genómica!
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| Sorgo (Sorghum bicolor) es pariente cercano de la caña de azúcar |
Resolver el rompecabezas
"Para hacer el cruzamiento de la caña de azúcar, necesitamos entender la genética de la planta. Esta comprensión necesariamente implica la secuenciación de su genoma", dice Souza. "La complejidad del ADN de la caña de azúcar ha impedido su secuenciación. Podemos obtener las secuencias de genes, hay máquinas que simplemente hacen eso. El problema es cuando se trata de armar las piezas del rompecabezas. No pudimos juntar las secuencias en el orden correcto. No sabemos en qué cromosomas se quedan. No podemos identificar genes específicos, ya que hay 12 tipos para cada gen".
Pero para todo siempre hay una solución. En lugar de tratar de secuenciar millones de bases al mismo tiempo, Anete Pereira de Souza y su equipo decidieron tratar de identificar genes o conjuntos de genes cuyas funciones específicas son de interés para el mejoramiento genético. ¿Cómo identificarlos si hay múltiples tipos de cada gen? La respuesta es, por similitud, la comparación de genes de caña de azúcar con genes similares, cuyas funciones se conocen, en el genoma ya secuenciado a partir de sorgo (Sorghum bicolor).
"Todo el mundo quiere secuenciar la caña de azúcar. Hemos desarrollado una estrategia para secuenciar regiones específicas del genoma de la caña de azúcar por similitudes con el genoma del sorgo", revela Souza. El estudio acaba de publicarse en la revista Frontiers in Plant Science.
Entre los pastos, el sorgo es el pariente más cercano de Saccharum. Ambos comparten un ancestro común que vivió hace unos 3.5 millones de años. A diferencia de la confusión genómica octoplasmática de S. officinarum, el sorgo es diploide, es decir, tiene solo dos copias de cada uno de sus 10 cromosomas, con un total de 730 millones de bases, una fracción de los 10 mil millones de pares de caña de azúcar.
La región en el genoma de sorgo que es responsable de la acumulación de azúcar ya es conocida. "Dado que ambas especies están estrechamente relacionadas, suponemos que los genes para la producción de azúcar en el sorgo dulce deben conservar la misma función en la caña de azúcar", dice Souza. "Por lo tanto, nuestro trabajo tuvo como objetivo identificar esta misma secuencia genética dentro del genoma de la caña de azúcar".
El punto de partida para el proyecto se dio en 2011, cuando el becario postdoctoral de Souza, Danilo Augusto Sforça, partió para el Instituto Nacional de Investigación Agrícola de Toulouse, Francia, para establecer bibliotecas de BAC para el genoma de la caña de azúcar con la ayuda y colaboración de la Dra. Helenè Bérges.
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| Los genetistas Danilo Sforça y Anete Pereira de Souza, en el laboratorio de Unicamp |
Las bibliotecas de BAC, o bibliotecas de cromosomas artificiales bacterianos, sirvieron como punto de partida para la secuenciación de varios organismos con genomas grandes, incluyendo ADN humano y ADN de trigo. Las bibliotecas BAC se desarrollaron para permitir la clonación y el almacenamiento de fragmentos de ADN dentro de bacterias tales como Escherichia coli. Tales bacterias tienen la capacidad de absorber tramos de ADN de otros organismos en la célula bacteriana en forma de ADN circular (plásmidos). Una vez que el fragmento de ADN a preservar se ha insertado en la bacteria, se congelan y almacenan. Cuando llega el momento de manipular el ADN insertado en la bacteria en forma de plásmidos, es suficiente para que el investigador descongele la bacteria y la deje multiplicarse. Pronto tendrá billones de clones, cada uno con una copia del ADN alienígena que desea estudiar.
A partir del ADN de dos variedades de caña diferentes, Sforza construyó dos bibliotecas BAC. Cada biblioteca tiene aproximadamente 200,000 piezas del genoma de la caña de azúcar. Estos se incluyeron en las bacterias y se almacenaron en 576 tabletas, cada uno con 384 piezas de DNA de la caña de azúcar, congelado a 80 ° C bajo cero.
"Es como si tomaras un pedazo de un cromosoma de caña de azúcar y lo colocaras dentro de una bacteria. Las bacterias son muy fáciles de manipular, extraer, multiplicar y secuenciar", explica Sforça. "Si queremos acceder a un gen de un cromosoma de la caña de azúcar, podemos".
Según Souza, "en un banco de clones puedo buscar las partes específicas de un genoma particular que me interesan. Las posibilidades son infinitas. Conociendo el gen del sorgo para la acumulación de azúcar, solo tienes que encontrar una secuencia similar en la biblioteca BAC de caña de azúcar "
Cuando terminó su trabajo en Francia, Sforça trajo sus bibliotecas a Campinas, Brasil. Luego comenzó el trabajo de la becaria postdoctoral Melina Mancini. Fue ella quien decidió buscar en las bibliotecas BAC buscando secuencias similares entre el sorgo y la caña de azúcar. "Elegí trabajar con una característica vinculada a la producción y acumulación de azúcar. Una vez que identificamos la región responsable de la acumulación de azúcar en el genoma del sorgo, fue fácil localizar secuencias similares en la caña de azúcar en las bibliotecas de BAC".
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| Una de las 576 placas (cada una con 384 piezas de ADN) que conservan el genoma de la caña en la biblioteca de BAC |
Mancini desarrolló algunos marcadores genéticos para buscar secuencias de sorgo en las bibliotecas de BAC. La región específica del ADN de sorgo que contiene los genes para la acumulación de azúcar es de 500,000 pares de bases. Ella fue capaz de identificar genes con una secuencia similar en la caña de azúcar. Los tramos de ADN de caña de azúcar seleccionados por los marcadores moleculares en las bibliotecas de BAC se secuenciaron y organizaron en el orden correcto encontrado en el genoma de la caña de azúcar. Se obtuvo así una secuencia continua de 1,2 millones de bases correspondientes en la caña de azúcar a la región del genoma del sorgo que contiene las 500,000 bases.
"Identificamos y montamos 68 secuencias continuas (un total de 1.2 millones de bases) que se suponía estaban relacionadas con la producción de azúcar", dice Mancini. El siguiente paso fue organizar las 68 secuencias correspondientes a 1,2 millones de bases en una secuencia continua. Mancini fue capaz de montar una secuencia de bases con nueve lagunas. Un trabajo de sintonía fina hizo que seis lagunas fueran llenadas. Se quedaron tres lagunas para que los 1,2 millones de bases formen un único fragmento.
Utilizando el genoma de sorgo como referencia, se identificaron 253 genes que codifican la acumulación de azúcar en el genoma de la caña de azúcar. De estos, 74 genes de sorgo se encontraron en los 500,000 pares de bases estudiados, mientras que solo 59 de ellos se encontraron en 1,2 millones de pares de bases en la caña de azúcar.
Los siguientes pasos de la investigación incluyen intentar cerrar las tres lagunas para obtener una secuencia completa. Según Mancini, "trataremos de descubrir qué partes de los genes de este genoma de la caña de azúcar híbrida (S. hybridum) provienen de los genomas de S. officinarum y que provienen de S. spontaneum".
Otro aspecto importante que queda por confirmar es si la función de los 253 genes que se encuentran en la caña de azúcar realmente es producir y acumular azúcar. No es suficiente saber que realizan esta función en sorgo, arroz y maíz. Tiene mucho sentido pensar que es lo mismo con la caña de azúcar. Pero la ciencia no funciona de esa manera. La ciencia requiere pruebas. Por lo tanto, es absolutamente necesario demostrar que la acción de esos genes de la caña de azúcar es hacer azúcar.
Interés nacional
"Mi interés en esta investigación no es secuenciar todo el genoma de la caña de azúcar", dice Souza. "Lo que me interesa es secuenciar regiones importantes que codifican genes para la producción de azúcar, o que pueden conferir tolerancia a plagas, resistencia a enfermedades o permitir la plantación de caña de azúcar en varios tipos de suelo, con más o menos luz solar, agua, fertilizantes, etc. Mi investigación tiene como objetivo ayudar al trabajo de mejoramiento genético de caña de azúcar ".
Brasil es el mayor interesado. Las cifras del sector del azúcar y alcohol en el país son muy impresionantes. El país es el mayor productor mundial de caña de azúcar. En la cosecha 2016/2017, se cosecharon 657,2 millones de toneladas, casi el doble de la producción del segundo productor, India. En la misma cosecha, se produjeron 11 mil millones de litros de etanol, suficientes para abastecer a 25 millones de vehículos de combustible flexible, o el 60% de la flota brasileña de vehículos. Las consecuencias del descubrimiento de genes para la acumulación de azúcar hecho por Souza y su equipo pueden, en un futuro no muy lejano, aumentar estos números. Exponencialmente
El proyecto de secuenciación de caña de azúcar liderado por Anete Pereira de Souza cuenta con el apoyo de la FAPESP, CNPq y CAPES.
CONTACTO PARA ENTREVISTAS:
Prof Dr. Anete Pereira de Souza
Laboratório de Análise Genética Molecular
Instituto de Biologia (IB)
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Campinas-SP
Brasil
Brasil
Teléfono: (55 19) 3521-1132
Celular: (55 19) 99111-6547
Celular: (55 19) 99111-6547
e-mail: anete@unicamp.br
REFERENCIAS CIENTÍFICAS:
Mancini MC, Cardoso-Silva CB, Sforça DA and Pereira de Souza A (2018) “Targeted Sequencing by Gene Synteny,” a New Strategy for Polyploid Species: Sequencing and Physical Structure of a Complex Sugarcane Region. Front. Plant Sci. 9:397.
doi: 10.3389/fpls.2018.00397
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